多重连接探针扩增（简称 MLPA）是一种高效、特异的分子生物学技术，主要用于对待检DNA序列进行定性和半定量分析。它结合了PCR（聚合酶链式反应）和连接酶技术，通过设计特定的探针来识别和扩增目标DNA序列，能够在一个反应中同时检测多达40-50个核苷酸序列的拷贝数变异和序列变异。
一、多重连接探针扩增技术原理与试验步骤
MLPA的基本原理包括探针与靶序列DNA杂交、连接、PCR扩增、片段分离及数据分析。其标准试验步骤主要分为以下六步：
1.变性：将DNA标本放入PCR仪中加热（通常为98℃加热5分钟），使DNA双链解链成单链。
2.杂交：加入包含特异性探针和缓冲液的杂交反应液。每组探针包含多对不同的寡核苷酸探针（左探针和右探针），它们分别与靶序列的相邻区域进行杂交。
3.连接：加入连接酶反应液。连接反应具有高度特异性，只有当两个探针与靶序列互补杂交时，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链。如果靶序列与探针序列不W全互补（即使只有一个碱基的差别），连接反应便无法进行。
4.PCR扩增：加入PCR聚合酶混合液。所有成功连接的探针均使用一对通用引物（其中一条带有荧光标记）进行指数级扩增（通常循环35次），荧光标记随之被带入扩增产物中。
5.片段分离：扩增完成后，利用毛细管电泳根据片段的长度对产物进行分离，并将不同长度的片段显示为峰值模式（电泳图）。
6.数据分析：将毛细管电泳得到的数据输入分析软件。通过将待测样本与一组参考样本的探针峰高进行对比计算探针比率，从而判断基因的拷贝数。例如，比值为1.0表示正常（两个拷贝）；比值为0.5可能意味着杂合缺失；比值为1.5则可能存在杂合复制。
二、主要应用领域
MLPA技术通量高、分辨率高、简便灵活，且最小仅需20纳克DNA模板，目前已广泛应用于以下领域：
1.遗传性疾病诊断：检测因大片段DNA缺失或插入导致的遗传病，如杜氏肌营养不良症（DMD）、神经纤维瘤、结节性硬化症等。
2.染色体异常检测：检测染色体亚端粒的微小基因重排、染色体的非整倍性改变（如针对13、18、21、X、Y染色体的产前检测）。
3.肿瘤诊断与预后：分析肿瘤相关的拷贝数改变以及抑癌基因的甲基化失活情况。
4.病原微生物检测：在动物疾病检测中，用于高通量、特异性地检测混合感染的病原体。
与传统的染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）或多重PCR相比，MLPA具有显著优势：
1.高特异性与分辨率：能够区分单个碱基的差异，精准检测单一外显子级别的缺失和插入突变。
2.样本需求量极低：对样本DNA量要求极低，且结果不受样品DNA量的影响，甚至无需体外细胞培养即可检测羊水等样本。
3.经济高效：一次反应可同时检测几十个靶位点，费用相对较低，且重复性好、简单易操作。
4.仪器门槛低：只需普通的PCR仪和毛细管电泳测序仪即可完成实验。
