液相色谱建立梯度洗脱的方法

液相色谱仪建立等度洗脱方法的主要步骤如下：

1 选择基本色谱条件：

色谱柱：15mm×4.6mm或25mm×4.6mm，C₈或C₁₈反相填料，5μm粒度。

流动相：水-乙腈（5~99%）B可变。

梯度时间为：25min（2mL/min）到50min（1mL/min）。

2 调整梯度范围

尽可能减少分离开始和结束时的时间浪费（没有色谱峰只走基线。

3 调整分离度

如果色谱图有很多峰分离度不好，可以延长tG，要延长天G可以增加柱长，减小填料的颗粒度，降低流动相速度。调节tG、流动相速度和柱尺寸来保持平均容量因子值。

4 调节峰容量

调节到色谱图中能容纳所有的峰，改变流速以便使峰与峰的距离合适

5 如果要进一步改变峰间距，就改变有机溶剂的成分。

6 如果样品的相对分子质量大于500，就按S比例增加tG。S 可按下面数据进行估计：