操作流程 3

安全预防

• 当使用 qEV 柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜。

• 柱子的 溶液包含 0.05% w/v 的叠氮化钠。大量的 有毒，所以应该避免皮肤和眼睛的直接接触。

• 废弃缓冲液应妥善处理。 会在铜制管道中累积引起爆炸。

• 生物样品可能有危险，当使用 qEV 柱时，请教实验室安全员有关样品安全操作的要点。

保存

柱子保存在含有抑菌剂（例如 20 %乙醇，或<0.05 % w/v 的 ）的溶液中，存放于+4到+8 °C。抑菌剂可以在冲洗步骤时引入（见囊泡收集后部分）。

使用前

如下图所示：

• 将柱子固定，使液面水平（确保柱子垂直）

• 不要移除底部滑动盖

• 小心缓慢地移去顶盖

柱子的平衡

• 移除底部滑动盖，并且使用至少 10 mL 洗脱缓冲液（PBS）冲洗柱子。如果不是使用PBS 洗脱，那么至少使用 30 mL 洗脱缓冲液冲洗柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子。

• 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

• 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

• 使用当天新配的过滤（0.2 μm）缓冲液避免引入颗粒物污染。

• 为了 的结果，建议购买 Izon Prep andReagent 试剂盒。

• 如果在操作温度范围之外使用，可能会得到错误的结果。

样品的纯化

一.样品的引入的应用

1. 在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

2. 加入 500 μL 样品。

3. 立即移去底部滑动盖。

4. 立即开始收集 0.5 mL 馏分；

• 开始的六个馏分（3.0 mL）是空隙体积，不包含囊泡，通常无需分析。

• 建议将空隙体积收集在同一个收集管中来节约时间，并可避免 6 个单独的管子带来的测量误差。

5. 当 的样品刚刚进入柱子顶部筛板（与之相平），加入更多的缓冲液，但是不要高于顶部筛板 2 mL。

• 等待直到 一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释。

二. 样品馏分收集

当依据操作流程使用 qEV 柱时，EVs 大多数洗脱于馏分 7、8 和 9 中，去除了～99.8 %的蛋白；

大于 10 的馏分包含更多的蛋白和更少的囊泡，不建议分析。为了得到更高的 EV 回收率，馏分可以合并起来，但是，合并馏分会稀释 EVs 的浓度。

方法 A — 得到 的纯度和浓度

不同的样品会得到不同的洗脱峰形，因此建议预先测量 EV 浓度并对所有馏分（7 - 11）进行蛋白纯化。

1. 空隙体积之后立即收集 3 个囊泡馏分，每个馏分 500 μL（馏分 7、8 和 9）。

2. 测量每个馏分的 EV 浓度（使用 IzonqNano）和蛋白纯度。

• 为了得到高浓度囊泡，使用 EV 浓度的馏分（通常 7 和 8）。注意：合并馏分会稀释 EV 浓度。

• 为了得到高纯度囊泡，使用 蛋白浓度的馏分。

方法 B — 一般使用操作

空隙体积之后立即收集一个囊泡馏分，1500μL。为了减少蛋白污染，建议只收集 1000 μL。

三. 囊泡收集后

当收集完囊泡馏分之后，用至少 10 mL 缓冲液冲洗柱子，并按照《保存》部分的要求保存柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸流过尺寸排阻柱所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。

qEV 柱的维护

再次使用

如何检测柱子何时被污染并需要清洁；

• 流速相比初始流速开始变缓。因此建议测量初始冲洗流速（和／或空隙体积）作为对比。