在诸多显微镜的观察模式中，明场成像得到的是光强度最直接的变化，相差成像等技术也大多是将光的相位差等转变为强度差，使人眼能够感受到。荧光成像技术则是特异性地区分出光的波长，也就是光的颜色，使人眼能够区分。
光被人眼所看到分为两种形式：发光和反光。明场成像属于反光形式，荧光则属于发光形式。
物体获得能量后可能产生发光现象，能量来源可能是热能（如白炽灯），化学能（如萤光）或者核能（如阳光），而荧光的能量来源则是另一束能量更高的光。
高能量的光子与电子碰撞，使得电子从基态跃迁到激发态。激发态的电子很不稳定，会重新回落到基态，这个过程中会消耗部分热能，并发出新的光子。新的光子能量比最初的光子能量低，因此波长更长。由于新的光子波长区别于入射光的光子波长，通过一定的光学处理方法将两束不同波长的光分开，从而使我们只看到发射出来的新光子（荧光信号），也就是荧光显微镜看到的荧光图像。
具有荧光特性的物质叫荧光素，不同的荧光素对不同波长的入射光激发效率不同，这种差异体现在荧光素的激发光谱上。同样的，不同荧光素发射出的新光子波长也不同，这种差异体现在荧光素的发射光谱上。因此，了解一种荧光素的实验方法，主要是了解其激发和发射光谱，其中发射光谱是荧光素的特征光谱。
实现入射光与发射光分离的部分是荧光显微镜的核心，通常采用三片滤光片结构。
以白光作为激发光源时，利用块激发光滤光片将白光过滤，使荧光素对应的激发波长的光透过。二向色镜是这个结构的核心，它负责将入射光与发射荧光分开，使入射光反射进入物镜，照射到样本上，样本中的荧光素便被激发产生荧光，发射出来的荧光被物镜收集后，穿过二向色镜。荧光再通过发射光滤光片，选择具有特征性的发射光范围，最终进入目镜或者成像设备中。
以上的结构是常见的荧光显微镜成像光路，也被称作反射荧光光路。
荧光照明的光源有很多种，理论上普通的白光光源也可以，但是实际上因为荧光的激发效率很低，因此需要亮度足够的光源。目前常用的荧光光源有4种：
汞灯：汞蒸气激发光源，传统荧光光源。
氙灯：氙弧光灯，光谱连续且强度平均。
激光：单色性好，强度高。
LED：寿命长，单色性较好，亮度高，是今后光源的主要发展方向。
荧光成像的优势：
通过二向色镜将入射光和荧光区分开，使我们只看到荧光信号，没有其他光线的干扰，因此可以看到很微弱的信号，比如单分子荧光。
因为荧光素可以特异性地标记到不同的细胞或分子上，因此可以区分不同的细胞或分子。
不同强度的荧光可以进行比较，从而实现细胞或分子的定量分析。
目前更的显微镜系统，如共聚焦显微镜、双光子显微镜、超高分辨率显微镜、光切片显微镜等都是利用荧光成像方法进行观察和分析的。
