层析柱装柱步骤流程

层析柱装柱流程

1.      计算每厘米柱床高度填料的数量；

2.      选择合适的配件和末端筛网，选择不合适的滤网可能导致较高反压或填料泄露；

3.      选择装柱流速

首先：拍排泡

第二：调水平

第三：匀浆

第四：装柱

第五： 绘制压力/流速曲线，装柱流速为流速的70%-99%。

柱效检测

柱效主要取决于装柱质量。如果是离子交换或亲和层析填料，则不能使用有色物质，如蓝色葡聚糖。表征柱效的两个指标是理论板当量高度（HETP）和对称因子A_s，使用NaCl或丙酮通过测定UV吸收或电导率进行计算。

使用NaCl溶液进行测定，优点样品是易得、安全，缺点是可能与填料发生反应，特别是离子交换树脂，因此影响测定结果。使用丙酮进行测定，其不与层析填料发生反应，并且可通过检测280 nm处的紫外吸收进行测定，并且，测定缓冲液的浓度可提高至10倍。

1.     HETP计算

所用样品为1.0%NaCl或纯丙酮溶液，上样大约为总柱床体积的1%。对于34和50μm的填料，使用的线性流速应为30 cm/h，90μm的填料选择20 cm/h的线性流速。通过下式计算HETP:

HETP = L/N

其中L为柱床高度（cm），N为理论塔板数，N=5.54 (V_e/W_h)²；

Ve为洗脱体积（mL），Wh峰高一半处的峰宽（mL）。

2.     峰对称因子计算

洗脱峰的峰形应尽可能对称，即对称因子尽可能接近1。As按下列公式计算：

As = b/a

其中，a为峰高10%处的前半个峰宽，b为峰高10%处后半个峰宽。