细胞悬液混匀：根据实验要求制备细胞悬液，并在培养基瓶、培养瓶或其他容器中混匀。建议每层的工作容积为30-50 mL。
接种细胞悬液：使用移液管紧贴瓶壁缓慢地将细胞悬液加入到细胞培养瓶中，注意避免产生泡沫或气泡。使用10 mL移液管可以伸到培养瓶底部使培养基分散开，而25 mL移液管则只能伸到NEST标志的地方。
平衡液体：将培养瓶有NEST标志的一侧朝向自己，顺时针倾斜45度左右放置一段时间，使瓶中各个隔层的液体达到平衡。
水平放置培养瓶：轻缓地将培养瓶水平放置于工作台上，NEST标志面朝上。
晃动培养瓶：前后左右轻轻晃动多层瓶，使液体均匀分布在每层生长面上。注意晃动要轻柔，防止起泡沫和培养基渗漏到下层。
移除培养液：可以选择抽吸或倾倒培养基的方法去除培养基。抽吸时，将多层瓶倾斜45度，有NEST标记的一面朝向自己，使用10 mL或2 mL移液管抽吸培养基。
细胞的收集：用缓冲液清洗一遍以去除残留的血清，后加入消化液(每层大于5 mL)，混匀。消化大约2分钟后，用消化终止液中和消化液。采用移液管抽吸法或倾倒法将细胞悬液置于离心管等容器中。
冲洗培养瓶：用一定量的缓冲液冲洗多层瓶三次，将冲洗液同时置于离心管中，混匀计数或者传代接种。
放置于CO2培养箱：最后，将培养瓶水平轻缓转移放置于CO2培养箱中。
使用注意事项：
多层细胞培养瓶须小心操作，避免操作过程中产生气泡，因气泡能在挡板处形成虹吸桥而导致上层培养基流到最下一层。
