PCR基因扩增仪是分子生物学实验中用于体外扩增特定DNA片段的核心设备。其操作需严格规范以保证结果的准确性和重复性。PCR实验的核心是通过温度循环(变性、退火、延伸)实现DNA的指数级扩增，具体步骤可分为实验前准备、上机运行和结果分析三部分。
1.实验前准备
-模板DNA提取与定量：
从样本(如细胞、组织、血液等)中提取基因组DNA或RNA(若为RT-PCR需先反转录为cDNA)。提取后通过分光光度计(A260/A280比值)或荧光定量法(如Qubit)检测DNA浓度与纯度，确保模板质量(无降解、无抑制物)。
-引物设计合成：
根据目标基因序列设计特异性引物(长度18-25bp，GC含量40-60，避免二级结构)，并通过BLAST验证特异性。引物需用无菌TE缓冲液溶解至工作浓度(通常10μM/L)。
-加样与防污染：
将反应液分装至PCR管(或八连排管)，盖紧管盖(避免蒸发)。操作需在生物安全柜或超净台中进行，使用带滤芯枪头，防止气溶胶污染(尤其是阳性对照或高拷贝模板)。
2.上机运行程序
根据扩增目标(片段长度、引物特性)设置温度循环参数，典型程序如下：
-预变性：94-98℃(常用95℃)，2-5分钟(使DNA解链，激活热启动酶)。
-循环阶段(25-40次)：
-变性：94-98℃，15-30秒(破坏双链DNA)；
-退火：50-65℃(根据引物Tm值计算，通常Tm-5℃)，15-30秒(引物结合模板)；
-延伸：72℃，时间按片段长度调整(1kb/分钟，不超过5分钟)。
-终延伸：72℃，5-10分钟(确保所有片段延伸)。
-保存：4℃(短期保存)或终止程序(长期保存)。
3.结果分析
-电泳检测：取5-10μL扩增产物，用1-2琼脂糖凝胶电泳(电压100-150V，20-30分钟)，紫外灯下观察目标条带(与Marker对比判断大小)。
-实时荧光定量PCR(qPCR)：若使用荧光染料(如SYBRGreen)或探针(如TaqMan)，可通过仪器自带软件分析扩增曲线、熔解曲线(验证特异性)及Ct值(定量模板初始浓度)。
PCR基因扩增仪的优点：
1.高效性：传统方法数天的工作可在几小时内完成，提升研究效率。
2.高灵敏度：能将极微量DNA(如单个拷贝)扩增至可检测水平，适用于痕量样本分析。
3.强特异性：通过引物设计准确靶向目标序列，减少非特异性扩增。
4.操作简便：自动化程序控制取代复杂手工操作，降低技术门槛。
5.应用广泛：从基础科研到临床诊断(如传染病检测)、法医学鉴定等领域均有重要价值。
