在临床检测中，常用的是酶法测定，包含己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法。己糖激酶法利用己糖激酶催化葡萄糖与 ATP 生成葡萄糖 - 6 - 磷酸和 ADP，葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶再催化其与 NADP⁺反应，生成的 NADPH 在 340nm 处有特征吸收峰，吸光度与葡萄糖浓度成正比，该方法特异性强、准确度高，是临床血糖检测的金标准。葡萄糖氧化酶法则通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢与色原底物反应生成有色物质，其吸光度与葡萄糖浓度相关，操作简便，常用于快速检测。此外，还有斐林试剂法等化学方法，利用葡萄糖的还原性与碱性铜离子试剂反应生成氧化亚铜沉淀，通过沉淀量定量，但特异性较差，多用于定性或半定量分析。

葡萄糖测定的应用以临床诊断为核心，血糖检测是糖尿病筛查、诊断与病情监控的关键指标，空腹血糖、餐后 2 小时血糖测定可判断糖代谢状态。在食品工业中，用于检测饮料、糕点、蜂蜜等产品的葡萄糖含量，把控产品甜度与品质。在生物科研中，可监测微生物发酵过程中葡萄糖的消耗速率，优化发酵工艺；也可用于细胞培养体系的葡萄糖浓度检测，保障细胞生长环境稳定。

葡萄糖测定凭借高特异性与灵敏度，成为多领域重要的定量技术。