高效液相色谱仪（HPLC）的梯度洗脱通过动态调整流动相组成，可显著改善复杂样品的分离效果，尤其适用于多组分或极性差异大的样品分析。以下是梯度洗脱的具体操作步骤及关键注意事项：
一、操作前准备
流动相配制
溶剂选择：根据样品性质选择合适的有机溶剂（如甲醇、乙腈）和水相（如缓冲盐溶液），确保溶剂互溶且与色谱柱兼容。
梯度比例计算：根据目标分离需求，设计梯度程序（如0-5分钟：5%乙腈→20%乙腈；5-15分钟：20%乙腈→80%乙腈）。
脱气处理：使用超声波脱气或在线脱气机去除溶剂中的气泡，防止泵压波动或基线噪声。
色谱柱安装
选择与样品极性匹配的色谱柱（如C18反相柱），确保柱温箱温度稳定（通常25-30℃）。
安装时注意流动相方向（箭头标识），避免反向冲洗导致柱效下降。
仪器参数设置
流速：根据色谱柱规格设定（如1.0 mL/min），确保压力在仪器允许范围内。
检测波长：根据样品吸收特性选择（如254 nm用于通用检测）。
进样量：通常5-20μL，避免过量进样导致柱超载。
二、梯度洗脱程序设置
通过仪器软件编辑梯度表
时间轴设定：输入各时间点的溶剂比例变化。例如：
曲线类型选择：
线性梯度：适用于极性差异适中的样品。
阶梯梯度：适用于特定组分的分步洗脱。
非线性梯度（如指数、S形）：优化复杂样品的分离。
平衡时间设置
梯度结束后需保留足够时间（如5-10分钟）使色谱柱重新平衡至初始条件，避免下一针基线漂移。
启动泵与检测器
打开泵，缓慢增加流速至设定值，观察压力是否稳定（通常10-30 MPa）。
开启检测器，预热至稳定状态（如DAD检测器需预热30分钟）。
进样与数据采集
使用自动进样器或手动进样针注入样品，避免气泡进入。
启动数据采集，观察基线是否平稳（噪声应<0.5 mAU）。
实时监控与调整
若压力骤升或基线波动，立即暂停运行，检查：
流动相是否脱气全。
色谱柱是否堵塞（可反冲或更换预柱）。
泵密封圈是否泄漏（观察漏液或压力不稳定）。
四、后处理与分析
色谱图积分
使用软件（如Chromeleon、OpenLAB）对峰面积或峰高进行积分，计算各组分含量。
调整积分参数（如阈值、斜率）以准确识别目标峰。
方法验证
重复性：连续进样5-6次，计算保留时间和峰面积的RSD（应<2%）。
线性范围：配制不同浓度标准品，绘制标准曲线（R?>0.995）。
回收率：添加已知量标准品至样品中，计算回收率（通常80%-120%）。
仪器清洗与保存
梯度洗脱后，用高比例有机相（如90%乙腈）冲洗系统30分钟，防止盐沉积。
更换流动相时，先用异丙醇过渡，再切换至新溶剂。
长期不用时，拆下色谱柱，用甲醇封存，避免柱床干裂。
五、常见问题与解决方案
基线漂移
原因：流动相未平衡、检测器污染或温度波动。
解决：延长平衡时间、清洗流通池、稳定室温。
峰形拖尾
原因：色谱柱过载、样品溶解性差或进样量过大。
解决：稀释样品、减少进样量或更换色谱柱。
保留时间重复性差
原因：泵流速不稳定、柱温波动或流动相比例误差。
解决：校准泵流速、检查柱温箱、使用高精度比例阀。
六、优化技巧
梯度延迟体积补偿：若仪器延迟体积较大（如>1 mL），需在方法中设置“延迟体积”参数，确保梯度准确到达色谱柱。
二元泵混合校准：定期使用标准品验证梯度比例准确性，避免因泵校准偏差导致分离不良。
保护柱使用：在分析柱前加装保护柱，延长色谱柱寿命，尤其适用于含颗粒或强保留物质的样品。
