**法定义（2005年版一部）
附录ⅩⅥ **法
**法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。本法适用于制剂、原料、辅料及等物品的**。
无菌物品是指品中不含任何活的微生物。对于任何一批**产品来说，优良无菌既无法保证，也无法用试验来证实。实际生产过程中，**是指将物品中污染的微生物残存概率下降*一定水平，以无菌保证水平SAL(sterilityassurance level)表示。*终**的产品微生物存活概率不得高10{-6}。已**产品达到的无菌保证水平可通过验证确定。
**产品达到的无菌保证不能依赖于*终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的**工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系。**工艺的确定应综合考虑被**物品的性质、**方法的有效性和经济性、**后物品的完整性等因素。
**程序的验证是无菌保证的必要条件。**程序经验证后，方可交付正式使用。验证内容包括：
（1）撰写验证方案及制定评估标准。
（2）确认**设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行（安装确认）。
（3）确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常运行（运行确认）。
（4）采用被**物品或模拟物品进行重复试验，确认**效果符合规定（性能确认）。
（5）汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。
日常生产中，应对**程序的运行情况进行监控，确认关键参数（如温度、压力、时间、湿度、**气体浓度及吸收的辐照剂量等）均在验证确定的范围内。**程序应定期进行再验证。当**设备或程序发生变更（包括**物品装载方式和数量的改变）时，应进行再验证。
产品的无菌保证与**前产品被污染的程度及污染的特性相关。因此，应严格监控被**品**前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生产的各个环节采取各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。
**冷却阶段，应采取措施防止已**物品被再次污染。任何情况下，都应要求容器及其密封系统确保产品的有效期内符合无菌要求。
**方法
常用的**方法有湿热**法、干热**法、辐射**法、气体**法和过滤**法。可根据被**物品的特性采用一种或多种方法组合**。只要产品允许，应尽可能选用*终**法**。若产品不适**用*终**法，可选用过滤**法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非*终**的产品作补充性**处理（如流通蒸汽**）。
一、湿热**法
本法系指将物品置于**柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法**能力强，为热力**中*有效、应用*广泛的**方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法**。流通蒸汽不能杀灭**孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助**手段。
湿热**条件通常采用121℃*15min、121℃*30min、或116℃*40min的程序，也可采用其他温度和时间参数，但必须保证物品**后的SAL《10-6。对热稳定的物品，可采用过度杀灭法，其SAL应《10-12。热稳定性较差产品的标准**时间F0［指**温度为121℃，生物指示菌的耐热参数D值为1分，**温度系数Z值为10.0℃时的标准**时间（121℃下计算的微生物等效灭活率）］一般不低于8min。如产品的热稳定性很差时，可允许湿热**的F0低于8，此情况下，应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降低微生物污染水平，确保被**产品达到无菌保证要求。
采用湿热**时，被**物品有适当的装载方式，不能排列过密，以保证**的有效性和均一性。
湿热**法应确认**柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂进一步确认**效果时，应将其置于冷点处。本法生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（sporesof Bacillus stearothermophilus）。
二、干热**法
本法系指将物品置于干热**柜、隧道**器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热**法**的物品**，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法**。
干热**条件一般为160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min以上，也可采用其他温度和时间参数。应保证物品**后的SAL《10-6。干热过度杀灭后物品的SAL应《10-12，此时物品一般无需进行**前污染微生物的测定。250℃*45min的干热**也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。
采用干热**时，被**物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证**的有效性和均一性。
干热**法应确认**柜中的温度分布符合设定的标准及确定*冷点位置等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）。**内**灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将小于1000单位的**内**加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内***少下降3个对数单位。**内**灭活验证试验所用的**内**一般为大肠埃希菌内**(Escherichiacoli endoxin )。
三、辐射**法
本法系指**物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法*常用的60Co-γ射线辐射**。、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法**。
采用辐射**法**后的产品其SAL应《10-6。γ射线辐射**所控制的参数主要是辐射剂量（指**物品的吸收剂量）。该剂量的制定应考虑**物品的适应性及可能污染的微生物*大数量及*强抗辐射力，事先应验证所使用的剂量不影响被**物品的安全性、有效性及稳定性。常用的辐射**吸收剂量为25KGy。对*终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量**。**前，应对被**物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价**过程赋予该**物品的无菌保证水平。
**时，应采用适当的化学或物理方法对**物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实**物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与**物品一起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时剂量计应用标准源进行校正，并定期进行再校正。
60Co-γ射线辐射**法常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores ofBacillus pumilus)。
四、气体**法
本法系指用化学**剂形成的气体杀灭微生物的方法。常用的化学**剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等，本法适用于在气体中稳定的物品**。采用气体**法时，应注意**气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。
本法中*常用的气体是环氧乙烷，一般与80%~90%的惰性气体混合使用，在充有**气体的高压腔室内进行。该法可用于，塑料制品等不能采用高温**的物品**。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用本法**。
采用环氧乙烷**时，**柜内的温度、湿度、**气体浓度、**时间是影响**效果的重要因数。可采用下列**条件：
温度 （54±10）℃
相对湿度（60±10）%
**压力 8*10〈5〉Pa
**时间 90min
**条件应予验证 **时，将**腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。**过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及**时间。必要时使用生物指示剂监控**效果。本法**程序的控制具有一定难度，整个**过程应在技术熟练人员的监督下进行。**后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残留物消散。并对**物品中的环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定的限度，避免产生毒性。
采用环氧乙烷**时，应进行泄露试验，以确认**腔室的密闭性。**程序确认时，还应考虑物品包装材料和**腔室中物品的排列方式对**气体的扩散和渗透的影响。生物指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢子（sporesof Bacillus subtilis)。
五、过滤**法
本法系利用**不能通过致密具空滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于热不稳定的药品溶液或原料的**。
**过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的**滤膜孔径一般不超过0.22um。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行**或作在线**。更换品种和批次应先清洗滤器，再更换滤膜。
过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值LRV（log reduction value)有关。LRV系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。即：
LRV =lgN0-lgN
式中 N0为产品**前的微生物数量；
N为产品**后的微生物数量。
LRV用于表示过滤器的过滤**效率，对孔径为0.22um的过滤器而言，要求每1cm2有效过滤器面积的LRV应不小于7。因此过滤**时，被过滤产品总的污染量应控制在规定的限度内。为保证过滤**效果，可使用两个过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤**中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤**前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验，确认滤膜在**过滤过程中的有效性和完整性。**过滤器的使用时间应进行验证，一般不应超过一个工作日，否则应进行验证。
过滤**法常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta)。
通过过滤**法达到无菌产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适当的方法进行**，并防止再污染。
六、无菌生产工艺
无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂的方法，无菌分装及无菌冻干是*常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤**法。
无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适当的方法进行**，并防止被再次污染。
无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装模拟试验验证。在生产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的无菌性。
无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培养基模拟灌装试验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认**设备的性能、**程序的验证、生产过程**效果的监控等。用于**验证中的生物指示剂一般是**的孢子。
1.制备生物指示剂用微生物的基本要求
不同的**方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：
（1）菌种的耐受性应大于需**产品中所有可能污染菌的耐受性。
（2）菌种应无致病性。
（3）菌珠应稳定。存活期长，易于保存。
（4）易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
2.生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，需先确定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）等。菌珠应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式。通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安培中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。载体和 包装材料在保护生物指示剂 不致污染的同时，还应保证**剂穿透并能与生物指示剂充分接触。载体和包装的设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。
有些生物指示剂可直接将孢子接种*液体** 物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
3.生物指示剂的应用
在**程序的验证中，尽管可通过**过程 某些参数的监控来评估**效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个**程序有效性*直观的指标。可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受性*强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际**条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证**程序有更大的安全性。在*终**法中，生物指示剂应放在**柜的不同部位。并避免指示剂直接接触到被**物品。生物指示剂按设定的条件**后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被杀灭。
过度杀灭产品**验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指示剂。对**手段耐受性差的产品，设计**程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批**前的微生物污染的数量、耐受性和**程序验证 所获得的数据进行评估。
4.常用生物指示剂
（1）湿热**法 湿热**法*常用的生物指示剂 为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 （Spores of Bacillus stearothermophilus,如NCTC 10 007、NCIMB8157、ATCC7953）。D值为 1.5~3.0min,每片（或每瓶）活孢子数5*10〈5〉~5*10〈6〉个，在121℃、19min下应被杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridiumsporogenes,如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955），D值为0.4~0.8min。
（2）干热** 法 干热**法*常用的生物指示剂 为枯草芽孢杆菌孢子（ Spores ofBacillus subtilis ,如NCIMB8058、ATCC 9372）。D值大于1.5min，每片活孢子数5*10〈5〉~5*10〈6〉个。去热原验证时使用大肠埃希菌内**（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000**内**单位。
（3）辐射 **法 辐射**法*常用的生物指示 剂为短小芽孢杆菌孢子（ Sporesof Bacillus pumilus ,如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142）。每片活孢子数10〈7〉~10〈8〉，置于放射剂量25KGy条件下，D值约3KGy。但应注意**产品中所负载的微生物可能比短下芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控**过程，但不能用于**辐射剂量建立的依据。
（4）气体**法 环氧乙烷***常用的生物指示菌为枯草芽孢杆菌孢 子（Spores of Bacillussubtilis,如NCTC10073、ATCC9372）。气态过氧化氢***常用 的生物指示剂 为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Sporesof Bacillus stearothermophilus,如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953）。每片活孢子数1*10〈5〉~5*10〈6〉个。环氧乙烷**中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿
度为60%，温度为54℃下**，60min应被杀灭 。
（5）过滤**法 过滤**法*常用的生物指示 剂为缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta ,如ATCC19 146），用于滤膜孔径为0.22um的滤器；黏质沙雷菌（Serratin marcescens）（ATCC 14756）用于滤膜孔径为0.45um的滤器。
