显微共聚焦激光拉曼光谱仪（Micro-Raman Spectroscopy）是一种结合显微镜和拉曼光谱技术的高精度仪器。其核心优势是可以在微米甚至纳米尺度上进行高分辨率的空间分析，通常应用于微小样品或具有复杂结构的样品（例如，单个细胞、微小颗粒或薄膜材料）的拉曼光谱研究。
在显微共聚焦激光拉曼光谱仪中，聚焦激光束是一个至关重要的步骤。聚焦过程的精确控制直接影响到拉曼光谱的空间分辨率和信噪比。以下是显微共聚焦激光拉曼光谱仪聚焦激光光束的基本原理与方法：
一. 激光聚焦原理
激光通过物镜进入显微镜系统后，会聚焦在样品表面。通过改变物镜的焦距（通常由显微镜物镜的数值孔径（NA）决定）以及样品的位置，可以将激光束聚焦到极小的区域，从而获取该区域的拉曼信号。
在显微共聚焦系统中，聚焦的过程依赖于以下几个方面：
1.激光光源：激光器产生具有特定波长和高强度的单色光。常用的激光波长包括 532 nm、785 nm、633 nm 等，这些波长的选择依赖于样品的激发特性。
2.物镜（Objective Lens）：物镜是聚焦激光和收集拉曼散射信号的关键部件，通常会使用高数值孔径（NA）的物镜，以提高焦点的光学分辨率。较高的NA值可以使激光光束更加聚焦，进而实现更高的空间分辨率。常见的物镜焦距范围从 0.5x 到 100x不等，焦距越短，聚焦点越小。
3.激光束路径：激光通过显微镜的光学系统进入样品，并聚焦于样品的表面或亚表面。激光经过物镜后会聚焦形成一个非常小的光斑，通常为微米级或更小的尺度。
二. 共聚焦技术的作用
显微共聚焦拉曼光谱仪的“共聚焦”是指拉曼信号的收集也通过聚焦光学路径实现的。共聚焦系统的核心是在激光聚焦点和拉曼信号接收路径之间使用一个针孔光阑（通常是一个小孔），它只允许来自焦点平面的散射光通过，阻挡焦平面之外的散射光。
1.拉曼信号的采集：拉曼散射光从样品表面发出，并通过物镜被收集。当拉曼散射光通过共聚焦系统时，只有位于焦点位置的散射光能通过针孔，其他位置的光被阻挡，这样可以显著提高信号的空间分辨率并减少背景噪声。
2.焦点控制：样品的垂直位置和光学系统的聚焦控制系统一起工作，确保激光焦点精确地定位在样品表面的感兴趣区域。
三. 聚焦过程的具体步骤
1.选择合适的物镜：根据样品的尺度和需要的空间分辨率，选择合适的物镜。高数值孔径（NA）物镜可以提供更高的聚焦能力和空间分辨率，但可能要求更小的激光功率。
2.调整激光功率和焦距：激光功率需要控制在合适范围，以免对样品造成热损伤。通过显微镜的焦距调整，可以将激光束精确聚焦到样品表面。
3.共聚焦调整：通过调整显微镜和拉曼光谱系统的共聚焦设置，确保拉曼信号的收集聚焦在正确的区域，并且通过光阑过滤掉非焦平面区域的散射光。
4.样品位置控制：使用显微镜的微调台（通常是电动控制的），精确调节样品的三维位置（X、Y、Z），确保激光聚焦点对准样品的目标区域。
四. 聚焦的影响因素
1.物镜的数值孔径（NA）：数值孔径越高，物镜的聚焦能力越强，能够聚焦成更小的激光斑点，因此分辨率更高。一般来说，数值孔径越高，空间分辨率越好，但光通量会减小。
2.激光波长：激光波长决定了激光在样品中的穿透能力以及拉曼散射光的波长范围。较短波长的激光通常具有较好的分辨率，但可能导致样品损伤。
3.样品的厚度与表面：样品的表面形态、厚度等因素也会影响聚焦效果。如果样品表面不平坦，可能需要通过样品的Z轴调节来保证激光焦点的精确定位。
五. 自动聚焦与调整
许多显微共聚焦激光拉曼光谱仪配备有自动聚焦功能，可以通过激光反射光或散射光的强度来自动调整聚焦点的位置。这种功能对于快速分析样品表面，尤其是样品表面不平坦时，非常有帮助。
总结
显微共聚焦激光拉曼光谱仪的激光聚焦是通过物镜、激光光源以及共聚焦光学系统来实现的。物镜的数值孔径、激光波长、样品的厚度和表面状况等因素都对聚焦效果和空间分辨率有着重要影响。通过精确的聚焦和共聚焦设置，可以获得高空间分辨率的拉曼光谱信息，这使得该技术在微小样品和复杂结构分析中具有重要应用。
