荧光滤光片一般采用单片无色透明的玻璃作为基底，在玻璃的两个表面镀膜。增反膜的厚度会选择为半波长的整数倍，此时反射叠加增强；增透膜的厚度为1/4波长的倍数，此时投射叠加增强。
荧光团会被高频率的照明(紫外、紫色或蓝色光谱区域内的波长)激发或吸收能量，然后会在频率较低的照明(绿色、红色或近红外光谱区域内的波长)中发射该能量。每种荧光团都具备了能够高效吸收能量的波长，又称为峰值激发波长λ (nm)，以及能够将所吸收到的多能量重新发射的对应波长，又称为峰值发射波长λ (nm)。选择单独荧光滤光片以及大透射的波长将能够确保您获得清晰度高的荧光图像。
1、滤光片的顺序不能颠倒，靠近光源处为吸热滤光片，次之应放置激发滤光片组合，而后为被检标本，最后安放阻挡滤光片，这是透射荧光显微镜的滤光片使用顺序。在落射荧光显微镜应用中在激发滤光片和被检标本之间必须加进色光分离反射滤光片(FT或RKP)。
2、使用滤光片时必须遵守斯托克斯定律：吸热滤光片的透射波长<激发滤光片的透射波长<色光分离反射滤光片的透射波长<阻挡滤光片的透射波长。
3、使用滤光片时必须注意配用滤光片的透射谱线之间越是相互靠近越好。
