液相色谱法

高效液相色谱法

5.1 概述

    高效液相色谱法（high performanc， liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。新型高效的固定相、高压、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来。

高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：

高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率，柱效一般可达每米10⁴理论塔板。近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米10⁵，能实现高效的分离。

高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。

高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达 10^-9～10^-11g

高度自动化计算机的应用，使 HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在状态下工作，成为全自动化的仪器。

应用范围广（与气相色谱法相比）  HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。

流动相可选择范围广，它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。

馏分容易收集更有利于制备。

5.2 高效液相色谱仪

高效液相色谱仪主要有分析型、制备型和专用型三类。

    一般由五个部分组成：

高压输液系统 —— 进样系统 —— 分离系统—— 检测系统 —— 数据处理系统

5.2.1高压输液系统

贮液器：贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，空隙大小一般为2m。

脱气装置：脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。

高压  高压是高效液相色谱仪的重要部件，是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。

对高压泵的基本要求是：

    ①流量稳定；②输出压力高，输出压力为50Mpa；③流量范围宽，可在0.01～10ml/min范围任选。④耐酸、碱、缓冲液腐蚀。⑤压力波动小。

梯度洗脱装置 

    梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度，以达到改变流动相极性、离子强度或pH值，从而提高洗脱能力，改善分离的一种有效方法。当一个样品混合物的容量因子是范围很宽，用等度洗脱时间太长，且后出的峰形扁平不便检测时，用梯度洗脱可以改善峰形、并缩短分离时间。HPLC的梯度洗脱与GC的程序升温相似，可以缩短分析时间，提高分离效果。使所有的峰都处于分离状态，而且峰形尖而窄。

5.2.2 进样器

    进样器一般要求密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力和流量波动小，并便于实现自动化。

    高压进样阀是目前广泛采用的一种方式。阀的种类很多，有六通阀、四通阀、双路阀等。以六通进样阀常用。

5.2.3分离系统

    色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱应具备耐高压、耐腐蚀、抗氧化、密封不漏液和柱内死体积小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱寿命长的要求。通常采用优质不锈钢管制成。

    色谱柱按内径不同可分为常规柱、快速柱和微量柱三类。

    常规分析柱柱长一般为10~25cm，内径4 ~ 5mm，固定相颗粒直径为 5 ~10 m。为了保护分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，约数厘米长，称为保护柱。（微量分析柱内径小于l mm，凝胶色谱往内径3～12 mm，制备往内径较大，可达25 mm以上。）

5.2.4检测系统

    检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。

5.2.4.1紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD）

紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。

紫外吸收检测器：

    紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190nm～800nm）。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。

    局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。

光电二极管阵列检测器（photodiodearray detector，PDAD）：

    也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(t_R)和波长()函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有性和灵敏度的波长。

下图是单光束二极管阵列检测器的光路图。光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。

二极管阵列检测器光路图

5.2.4.2荧光检测器（fluorescencedetector，FD）

     荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。

    近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。

5.2.4.3示差折光检测器（differentialrefractive Index detector，RID）

    示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。

5.2.4.4电化学检测器 （elec chemical detector，ED）

    电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获

得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。

    电化学检测器的优点是：

 ①灵敏度高，最小检测量～般为ng级，有些可达pg级；

 ②选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质；

 ③线性范围宽，一般为4～5个数量级；

 ④设备简单，成本较低；⑤易于自动操作。

5.2.4.5化学发光检测器 （chemiluminescence detector，CD）

    化学发光检测器是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。  

    这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10^-12g。

5.2.5数据处理系统

    早期的 HPLC 只配有记录仪记录色谱峰，用人工计算 A或 H。随着计算机技术的发展，简单的积分仪，可自动打印出 H、A和 t_R，作一些简单的计算，但不能存储数据。 

    现在的色谱工作站功能增多，一般包括：色谱参数的选择和设定：自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。

5.3 色谱分离条件选择

5.3.1减小柱内展宽，提高柱效

    固定相：①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；②改进结构，尽可能采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。

    流动相：选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数D_m，减少传质阻力。

    流速：从H-U曲线可知，HPLC的流速在流速很小处，减少流速有利于提高柱效，但在实践中为加快分析速度，常采用比流速高数倍的流速。

气相色谱(GC)和液相色谱(LC)的H-u曲线比较

    柱温：适当提高柱温，可降低流动相粘度，减少传质阻力，但柱温升高将使分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一般在室温下进行。

5.3.2 柱外展宽

    柱外谱带展宽又称“柱外效应”，系指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色谱峰展宽，柱效下降。可分为：

柱前展宽  主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。

柱后展宽  主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度等都是克服柱后展宽的途径。

5.4 液-固色谱法

5.4.1原理

    液-固色谱法是利用各组分在固定相上吸附能力的不同而将它们分离的方法。

    当组分随着流动相通过色谱柱中的吸附剂时，组分分子及流动相分子对吸附剂表面的活性中心发生吸附竞争。组分分子对活性中心的竞争能力的大小决定了它们保留值的大小。被活性中心吸附越强的组分分子越不容易被流动相洗脱，k值就大；反之k值就小。组分之间的k值相差越大，分离越容易。

    吸附剂吸附能力的强弱与吸附剂的比表面积、物理化学性质、组分分子的结构和组成以及流动相的性质等因素有关。

5.4.2固定相

     液-固吸附色谱所使用的固定相，多数是有吸附活性的吸附剂，常用的有表面多孔型和全多孔微粒型硅胶、氧化铝、分子筛等。

表面多孔型：又称薄壳型，是高效液相色谱使用的种填料。表面多孔填料的机械强度好，易填充均匀、紧密，渗透性好，表面孔隙浅，传质快，柱效高，分离速度快。其主要缺点是由于比表面积小，柱容量低，允许进样量小。

全多孔微粒型：目前广泛使用的有球形和无定形两种，颗粒直径3～10μm，它具有粒度小，比表面积大（100～600m²／g），孔穴浅，柱效高和柱容量大的优点。

5.4.3流动相

实现分离与流动相的选择有关。溶剂的极性是重要的依据。溶剂的极性强弱可用溶剂强度参数 ⁰ 来衡量。⁰ 越大，表示洗脱剂的极性越强。

吸附色谱流动相的选择原则是极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性较弱的洗脱剂。实际工作中常用两种或两种以上溶剂按不同比例混合作洗脱剂，以提供合适的溶剂强度和 k 值，提高分离的选择性。在分离复杂试样时，可进行梯度洗脱，能提高分离效率，改善峰形，加快分析速度。高效液相色谱法中，流动相选择虽然有一般的指导原则，但主要靠实践经验。

5.5化学键合相色谱法

5.5.1原理

     “化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。

    通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基， ≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。

从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡ Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用泛。这种键合相是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：

                                              Cl

︱

≡Si–OH + C₁₈H₃₇ SiCl₃→ ≡Si-O–Si–C₁₈H₃₇ + HCl

                ∣

                                              Cl  

    这种固定相在 pH = 2～8.5范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。

    十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane 简称ODS或C₁₈）： 是的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在70℃以下和 pH 2～8范围内可正常工作。

化学键合固定相具有如下优点：

  ① 柱效高：传质速度比一般液体固定相快；

  ② 稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；

应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。

5.5.2流动相

   化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：

正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。

    常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。适用于分离中等极性化合物，如、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。

反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。

    流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、*等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。

反相键合相色谱法应用泛，因为它以水为底溶剂，在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH 值和极性等，以提高选择性，而且水的紫外截至波长低，有利痕量组分的检测，反向键合相稳定性好，不易被强极性组分污染，且水廉价易得，安全。

5.6  离子交换色谱法

5.6.1原理

      离子交换色谱的固定相是交换剂，根据交换剂性质可分为：阳离子交换剂和阴离子交换剂。交换剂由固定的离子基团和可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与交换剂上可交换的平衡离子进行可逆交换，最后达到交换平衡，阴阳离子的交换平衡可表示为：

     阳离子交换：    R⁺Y^- + X^- = R⁺X^-+ Y^-

     阴离子交换：    R^-Y⁺ + X⁺ = R^-X⁺+ Y⁺

 R⁺ 、R^-—为交换剂上的固定离子基团，如RSO₃^-或RNH₃⁺；

 Y⁺、Y^-—为可交换的平衡离子，可以是H⁺、Na⁺或OH^-、Cl^-等

 X⁺ 、X^-—为组分离子。

    组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大，其保留时间长；反之，分配系数小，其保留时间短；因此：

离子交换色谱：是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。

5.6.2固定相

    离子交换色谱固定相：早期离子交换色谱法采用离子交换树脂作为固定相，有溶胀和收缩现象，不耐高压，而且表面微孔结构影响传质，柱效低，现已被离子交换键合相所取代。

    离子交换键合相：是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面经化学反应键合上各种离子交换基团。若带上磺酸基（－SO₃H 强酸性）、羧基（一COOH 弱酸性）就是阳离交换树脂；若带上季胺基（-NR₃Cl强碱性）或胺基（-NH₂弱碱性）就是阴离子交换剂。

5.6.3流动相

    离子交换色谱流动相：通常是盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的 pH、缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响样品的分离效果。常用的缓冲剂有：磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、氨水等。

5.7 尺寸排阻色谱法

5.7.1分离原理

    尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。

    排阻色谱的固定相多为凝胶。凝胶是一种由有机分子制成的分子筛 , 其表面惰性 , 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当 , 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内 , 但进不了小孔 , 甚至于被排斥，先流出色谱柱。尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。因此 , 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。

    当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：

X_m = X_n

组分的分配系数为：       

尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1

5.7.2固定相

    尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。

无机凝胶：又称硬质凝胶。是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。

有机凝胶：又称半硬质凝胶。如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。

5.7.3流动相

    尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大；能润湿凝胶，防止吸附作用。常用的流动相有*、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、（凝胶渗透色谱）；水（凝胶过滤色谱）等。 可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等。

5.8高效液相色谱法的应用

     高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。

5.8.1在食品分析中的应用

食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；

食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；

食品污染物分析：霉菌毒素（、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。

5.8.2在环境分析中的应用

    多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。

5.8.3在生命科学中的应用

    HPLC技术目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等的工具。其在生化领域的应用主要集中于两个方面：

低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。

高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。

    过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感性趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。

5.8.4在医学检验中的应用

    体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：

合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、、妥等）、黄胺类药等。

天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、碱、强心甙）等。

5.8.5在无机分析中的应用

    阳、阴离子的分析等。