葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
2.适用范围
适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02 mg。
3.仪器
722分光光度计。
4.试剂：
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1） 乙醇。
（2） 40% 三***：称取40g 三***，用水溶解并稀释至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：称取8g NaOH， 用水溶解并稀释至100ml。
（4） 1 % 邻联甲苯胺溶液：称取0.1 g 邻联甲苯胺溶解于10 ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5） 乙酸缓冲液 （pH 5.0）：称取14.28 g 乙酸钠 （CH3COONa•3H2O）溶于水中，加入2.7 ml冰乙酸，并调节pH 5.0， 用水定容至1 L。
（6） 葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量为100 U/ml。4 ℃冰箱保存一周。
（7） 过氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根过氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8） 酶溶液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃冰箱可保存七周。
（9） 酶空白液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10） 葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。**称取0.050 g，用水移入100 ml容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5 mg/ml。
5.操作步骤：
5.1样品处理：
（1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。
（2）液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。（如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15min，上清液备用。）
（3） 新鲜牛乳等样品：吸取0.5～2ml 样品，用水稀释，加入3ml 40% 三***溶液。用水定容至100ml，过滤。吸取5ml滤液，用2 mol/L NaOH 调节pH至中性，用水定容至10ml，备用。
（注：样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质，40% 三***用于沉淀蛋白。）
5.2测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作（单位：ml）
试 剂 | 标准空白管 | 葡萄糖标准管 | 样品空白管 | 样品测定管 |
葡萄糖标准液 | —— | 0.1～0.5 | —— | —— |
样品提取液 | —— | —— | 0.5 | 0.5 |
水 | 0.5 | 补至0.5 | —— | —— |
酶溶液 | 5 | 5 | —— | 5 |
酶空白液 | —— | —— | 5 | —— |
上述试剂混合后37℃ 水浴反应 15 min， 625 nm 测定吸光度值。
（注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。）
6.计算
根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。
计算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——样品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——样品定容体积，ml；
F——稀释倍数
0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml；
m——样品质量，g；
0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。
7.注意事项
（1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。
（2）如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。
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