使用说明:
对于培养细胞样品:
1. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最
终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干
扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解
液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解
液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞
量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于
裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
3. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫
共沉淀等操作。
裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适
当加大裂解液的用量到150微升或200微升。
对于组织样品:
1. 把切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最
终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的
裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫
共沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充
分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不
如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
附:各种裂解液主要特点、差异和选择
首先请参考下表,了解各种裂解液的主要特点和差异。
产品编号 | P0013 | P0013B | P0013C | P0013D | P0013F | P0013G |
产品名称 | Western及IP细胞裂解液 | RIPA裂解液(强) | RIPA裂解液(中) | RIPA裂解液(弱) | NP-40裂解液 | SDS裂解液 |
有效裂解成分 | 1% Triton X-100 | 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.25% deoxycholate | 1% NP-40 | 1% SDS |
裂解强度 | 温和 | 强 | 中 | 温和 | 温和 | 强 |
对膜蛋白的提取 | 一般 | 很好 | 较好 | 一般 | 一般 | 很好 |
对胞浆蛋白的提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
对核蛋白的提取 | 较好 | 很好 | 较好 | 较好 | 较好 | 很好 |
胞浆磷酸化蛋白提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
细胞核转录因子提取 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 | 很好 |
含蛋白酶抑制剂 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
含磷酸酯酶抑制剂 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 | 是 |
主要用途 | WB, IP,co-IP | WB, IP | WB, IP | WB, IP, co-IP | WB, IP,co-IP | WB, ChIP |
用于普通的Western、IP或co-IP,我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013),该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用,用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后,没有非常粘滞的透明状DNA团块形成,不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。
对于某些特殊蛋白的IP,如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想,可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高,即非特异的蛋白也被IP下来,则需要选用裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来,则说明裂解液的强度过强,可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。
对于某些难溶解蛋白的Western,如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想,可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
所有评论仅代表网友意见,与本站立场无关。